糖化血紅蛋白定量分析

  2011年世界衛生組織推薦:在有條件的地區采用糖化血紅蛋白(HbA1c)診斷糖尿病。HbA1c達標是糖尿病血糖控制目標以及評價糖尿病治療方案有效性的標準,是20世紀90年代中期開始在國際上逐步推廣應用的一個指標。目前,在相當一部分國家和地區HbA1c是糖尿病首選診斷指標,我國新版2型糖尿病防治指南(2013年版)建議:“暫不推薦在我國將HbA1c作為糖尿病診斷切點,但對于采用標準化檢測方法,并有嚴格質量控制,正常參考值在4.0%~6.0%的醫院,HbA1c≥6.5%可作為診斷糖尿病的參考。”因此,保證HbA1c測定質量十分重要。

  一、糖尿病首選的診斷指標

  糖尿病首選的診斷指標為什么是HbA1c而不是我們耳熟能詳的血漿(清)葡萄糖?這主要源于糖尿病診療理念的變遷。以往糖尿病主要是依靠臨床癥狀和體征而被定義、識別和診斷的,血糖水平僅作為確定診斷和鑒別診斷的輔助指標,隨著醫學的發展、進步,糖尿病已經從與機體不適和病痛相關的“臨床疾病”演變為依據與亞臨床性糖尿病微血管損害相關的血糖水平而診斷的“數字病”,在這種情形下,血糖水平的檢測從輔助診斷的位置上升到診斷糖尿病的主要地位。因此,血糖檢測的準確性、多次檢測的可重復性以及基于血糖的診斷方法的可操作性就成為人們越來越關注的問題,而采用簡單、易行且重復性好的糖尿病診斷工具也是現實糖尿病防治工作中提出的重要需求。

  傳統的血漿(清)葡萄糖測定存在一些無法解決的問題:首先是生物學變異大,同一個體內差異達到5.3%~8.3%,不同個體間則可以達到12.5%;其次是需要特定時間采血,空腹血糖需要空腹8h以上,口服葡萄糖耐量試驗更是耗時;還易受短期生活方式改變的影響;最棘手的問題是體外糖酵解,采血后離體血糖隨著時間的推移葡萄糖濃度會下降,即使采用氟化鈉作為糖酵解抑制劑,由于其作用機制是通過抑制參與糖酵解的酶的活性而達到抑制糖酵解的目的,所以其起效也要在4h以上;因此,無法達到檢測的準確性和多次檢測的可重復性的要求。而HbA1c由于是葡萄糖與血紅蛋白結合的穩定產物,所以其具有:離體樣本穩定,常溫可穩定24h;生物學變異小,在2.0%以內;且無需空腹,可任意時間采血;相對來講不受短期生活方式改變的影響等特點;更為重要的是,HbA1c測定有國際公認的參考體系,可以監測其結果的準確性;HbA1c還有一個非常突出的特點,那就是:與糖尿病血管并發癥的相關性好于血漿(清)葡萄糖。所以,HbA1c的測定能滿足糖尿病防治工作的需求。

  為適應HbA1c臨床應用發展的需要,提高HbA1c的測定質量,衛生部臨床檢驗中心等多家機構和醫院的檢驗學與臨床專家根據我國HbA1c檢測現狀、結合國內外相關理念共識和研究進展、經廣泛征求意見制定了《糖化血紅蛋白測定專家共識》(以下簡稱“共識”)。筆者從以下幾個方面進行評析、解讀,供相關同仁參考。

  二、知曉干擾因素、重視結果報告與臨床的結合

  隨著檢驗醫學的迅猛發展,現代檢驗醫學的理念已經發生了根本性的變革。臨床實驗室由以往的“以樣本為中心,以數據為目的、只見數據不顧人”,發展到現在以“患者為中心,為臨床診療提供可靠依據為目的”,不僅重視可能影響測定結果質量的各個環節,且綜合分析、全面評判可對檢測結果產生影響的多種因素。

  1.關于HbA1c的報告應提供“檢測方法學名稱”:

  人體是一個復雜的生物工廠,使得檢驗指標存在一些干擾因素,HbA1c也不例外。由于HbA1c是紅細胞中血紅蛋白與葡萄糖的結合產物,因此,任何引起血紅蛋白數量與質量變化的因素都可干擾HbA1c測定,對檢測結果產生影響。HbA1c測定的干擾因素包括:血紅蛋白病、紅細胞壽命的縮短或增加、藥物、嚴重黃疸、高脂血癥、族群、年齡及妊娠等。有些HbA1c測定方法可避免或在一定程度上減少一些因素的干擾。也就是說,有些人群(如某些血紅蛋白病患者)可以選擇不受自身疾病干擾的方法檢測HbA1c,這就是所謂的“方法學特異”。而“非方法學特異”是指無論采用何種方法都無法克服,如尿毒癥患者等人群不宜采用HbA1c來反映體內平均血糖水平。

  由于上述原因,使得HbA1c測定結果與臨床診療及表現不一致的情況時有出現,此時實驗室報告如能提供“方法學名稱”,可便于臨床醫師分析、判斷本醫療機構實驗室所采用的方法除了滿足大多數患者的需求外,是否還能滿足一些少數特殊患者的需求。因此,共識中建議:實驗室簽發的報告應提供“方法學名稱”。

  令人欣慰的是,隨著檢測技術的改進,常見的血紅蛋白病對一些檢測方法的干擾在逐漸降低,如血紅蛋白S和血紅蛋白C會干擾一些免疫法和個別離子交換HPLC法,血紅蛋白E和血紅蛋白D對一些離子交換HPLC法有干擾,但對免疫法基本沒有干擾。需要注意的是,某些離子交換HPLC法在參考范圍內不受血紅蛋白S、C、E和D的干擾,但隨著HbA1c濃度的增高,干擾也會增加;當血紅蛋白F濃度<10%時,基本不影響HbA1c測定結果,一旦濃度>10%,對目前國際上通用的方法幾乎都有干擾,干擾隨著濃度的升高而增加,這一點需注意。

  2.關于提供“參考范圍”:

  實驗室必須為檢測指標提供可靠的參考區間,才能使臨床醫師根據測定結果判斷健康者、了解患者病情,以發揮結果報告的作用。HbA1c作為有溯源性的診斷指標,其測定結果應該具有跨時空、跨檢測系統的一致性和可比性,也就是說,同一份樣本在不同時間、不同地點、采用不同品牌儀器進行檢測,其結果相差應該在一定的允許范圍內,這就是具有可比性。但事實上,由于各種各樣的原因,使得某些實驗室的HbA1c測定結果難以做到可比,導致參考范圍差別很大。據“中國糖化血紅蛋白教育計劃”對全國部分省、市的調查結果顯示:HbA1c的測定在許多不同級別的醫療單位都有開展;581家醫學中心的HbA1c報告參考范圍多數為可接受的4%HbA1c~6%HbA1c左右,但有一部分卻相差很大,低限為3%HbA1c~10%HbA1c,高限則可達到20%HbA1c。如實驗室報告能提供“參考范圍”,可便于臨床醫師了解、判斷檢測結果的可靠性,因此,共識中還建議:實驗室簽發的報告應提供“參考范圍”。

  臨床實驗室應避免頻繁變更檢測方法,如需更改,應提前與臨床醫師溝通,除告知影響方法測定結果的干擾因素外,還要盡可能提供相關的信息,以便于臨床醫師分析、判斷報告的可靠性,更合理地應用HbA1c結果。

  三、HbA1c檢測方法評價和選擇的重要性

  方法性能評價的重要性正被越來越多的醫學界同行所關注,從保證檢測質量的角度出發,臨床實驗室在使用新的方法對患者樣本進行檢測前,必須結合本單位的具體條件,用試驗結果去評價方法的基本性能,只有確認方法的分析性能符合臨床使用要求時,才可以將其用于實驗室常規工作。對方法性能的評價應做到2個方面:首先,按照正確的方法進行檢測;其次,按照正確的標準評估檢測結果。需要說明的是,方法不僅僅是儀器,還要包括試劑、校準物等,即所謂的“分析系統”,分析系統性能涉及儀器、試劑、校準物和質控物的批號、有效期、保存和使用條件、相關操作人員的能力、操作規程的合理性以及環境等因素。其中任何因素的改變,都會對檢測結果的準確性產生影響。如:不同批號的試劑是否有差異,不同操作人員的能力是否都符合要求,操作人員的生物安全是否有保障等。

  HbA1c測定方法有多種,不同方法所應用的原理不同,測定組分各異。20世紀90年代中期,美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃(National Glycohemoglobin Standardization Program,NGSP)及國際臨床化學與醫學實驗室聯盟(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)對HbA1c的測定進行標準化工作,明確了HbA1c分子結構,建立了國際公認的參考體系,因此,HbA1c測定是可溯源的,其結果的準確性可被國際參考體系評估。臨床實驗室所選擇的測定方法,應既能滿足簡便快速、可批量測定、及時發出報告的要求,也必須保證測定結果質量。采用可靠的方法進行檢測是保證結果質量的基本前提。對于HbA1c測定,目前的共識是:所用方法應該可溯源至IFCC參考方法,廠商應提供可溯源至IFCC參考方法的相關證明。可溯源的方法即標準化方法,具體體現就是經過有資質的、相關專業機構的認證,在此方面做了大量工作的是美國的NGSP。其通過對廠家方法的認證,從源頭對HbA1c檢測進行標準化;通過不斷提高認證標準,達到不斷提高出廠方法質量的目的,這也是NGSP對HbA1c測定實現標準化的重要貢獻。

  需要指出的是,得到NGSP認證的方法質量也是不同的,有些方法在使用一段時間后,尤其是在更換不同批號的試劑后,難以保證測定結果的可比性,因此,對分析系統性能的評價工作不僅僅是在分析系統使用前需要進行。對于沒有經過有資質的、相關專業機構認證的HbA1c檢測方法,不僅需對其精密度和準確度進行實驗,初步判定分析系統性能的可接受性,還需對其他結果的可接受性進行評判,如:干擾因素、可報告范圍等,從而對分析系統性能結果進行綜合評估,進而判斷整個分析系統的可接受性。

  1.HbA1c測定方法的精密度與準確度:

  精密度由不精密度體現,常用變異系數表達。對檢測方法而言,精密度通常是首先考慮的性能指標,因準確性建立在精密度基礎上,沒有好的精密度,其他指標都失去意義。目前國際上對HbA1c測定準確度的要求是:實測值與可接受參考值(真值)的差值在±0.5%HbA1c范圍內,如達到此測定質量目標,則應滿足室內變異<2.0%,只有控制此標準,才可控制室間變異<3.5%,從而達到±0.5%HbA1c測定質量目標。目前,一些在國際上普遍采用、質量比較可靠的方法均能達到此標準,但并不是所有,包括一部分得到NGSP認證的方法。對于HbA1c檢測來說,0.5%HbA1c是一個怎樣的概念呢?2009年,美國國家衛生統計中心對全國>25歲,且無糖尿病史的成年人調查結果顯示:以6.5%HbA1c為例,對應的人口數量是240萬;而減少0.5%HbA1c,也就是6.0%HbA1c的人數達到710萬;如果增加0.5%HbA1c,7.0%HbA1c的人口則銳減為150萬。真可謂“差之毫厘、謬以千里”。鑒于我國目前HbA1c檢測的具體情況,共識中建議:臨床實驗室應控制HbA1c測定的室內變異<3.0%,以達到室間變異<5.0%的要求,此HbA1c檢測質量可滿足HbA1c作為糖尿病血糖控制指標的需求,如能控制室內變異<2.0%,則檢測質量更有保障。精密度直接影響測定結果的準確性,因此,改善分析系統的精密度,是提高測定質量的重要措施。

  2.關于即時檢測(point-of-care testing,POCT)的HbA1c結果:

  快速、簡便、易于操作是POCT的特點,但同時也帶來了質量控制的難題。傳統檢驗一批試劑可測成百上千個樣本,質量是一致的,而POCT的每一個測試都是獨立的,如何保證每個測試的質量都一致,則是目前面臨的最大難題。近幾年,業界權威雜志連續發表專家述評、方法學評價報道:大多數通過NGSP標準化認證的POCT方法檢測HbA1c結果的精密性、準確性無法滿足臨床需求。曾有權威實驗室對市場上常見的8款HbA1c的POCT產品性能進行全面質量評價,結果顯示:6款產品質量無法達到要求,其中,不同批號試劑對測定結果的影響尤為突出。一些糖尿病組織明確規定,POCT測定結果不能用于糖尿病診斷。美國糖尿病學會在2014年初更新的《糖尿病診療規程》中則建議,HbA1c的POCT結果可用于糖尿病監測。

  以上問題提示,對檢測方法正確的評價和選擇是保證HbA1c測定質量的基本前提。

  四、應加強規范化操作的理念

  規范化操作在檢測過程中起著舉足輕重的作用,檢測不僅需要可靠的方法,還必須有合理、規范的操作過程,才能得到準確的結果。以2012年臨床檢驗中心室間質量評價調查為例:此次活動共發放5個濃度水平的新鮮冰凍全血樣本,按照方法分組,為:有一點需要“可通過標準”靶值±12%×靶值,說明的是,我們的“可通過標準”相比同期國際標準要寬松。結果顯示,5個水平中沒有一個方法組的通過率為100%,包括目前國際上普遍采用的、質量比較可靠的方法組,也就是說,有的實驗室雖然使用了比較可靠的方法,但測定結果質量卻不高,沒有達到預期效果。這說明操作可能并沒有達到規范化,所以,在此強調:應注重操作人員綜合能力的培養,因為再先進的儀器都有其局限性或不足,需要操作者不僅按照標準操作程序完成操作過程,還應對可疑結果作出合理、正確的研讀和判定,杜絕錯誤報告的發出。

  五、質量控制在HbA1c測定全程質量保證工作中的作用

  質量保證是臨床最為關注的問題,直接關系到醫療水平及醫師、患者切身利益,唯有把握好質量控制工作,才能保證測定結果質量。結果質量監測主要由2部分組成:內部質量控制和外部質量評價。內部質量控制的主要目的是監測分析系統穩定性,即進行室內質控物的測定,通過對質控物的測定,評估系統的精密度,以達到了解、控制系統穩定性的目的。實驗室分析系統精密度的合理估計應包括批內和批間兩部分,因此,應收集不同批次的重復測定結果以估計總變異,并作為常規分析數據質量控制的依據,其結果的有效性、可靠性隨時間的延長而增加。

  選擇HbA1c室內質控物時應特別注意質控物在使用過程中存在的“互換性”問題,由于凍干粉質控物與患者新鮮血之間存在差異,在更換試劑批號或儀器的關鍵配件(如色譜柱)時凍干粉質控物可能表現出不同的基質效應,因此會對測定結果有一定的影響。

  外部質量評價的目的是監測測定結果準確性,主要體現方式為室間質量評價(external quality assessment,EQA)或能力驗證(proficiency testing,PT),室間質量評價是目前國際通用的評價實驗室質量也會不斷提高。測定結果可靠性從而改進測定質量的有效手段,通過室間質量評價活動可獲知同一方法在不同實驗室間的不精密度,可以提示室內質控難以發現的偏差和系統誤差,識別問題并制定相應的改進措施。對HbA1c測定而言,目前的要求是,不同測定方法的結果應具可比性,不同方法組應采用同一靶值進行評價,這就對方法精密度提出了更嚴格的要求。由于不同基質效應的問題,HbA1c室間質量評價所用樣品應盡量采用新鮮患者樣本,樣本濃度也應當接近醫學決定水平,這對于HbA1c用于無癥狀人群的篩查、血糖管理治療方案的制定及判斷療效非常重要。

  HbA1c的臨床實驗室常規測定方法自20世紀70年代末問世以來,幾經變革及改進,我國目前不同實驗室使用方法種類繁多、品牌各異,有些實驗室的檢測質量與國際水平有一定差距。雖然這種現狀在短時間之內難以改變,但我們可以把握一個原則,那就是:使用質量有保證的實驗室的檢測結果。實驗室如能做到根據患者臨床診療的實際需求,選擇恰當的方法、準確地進行檢測、全程監測結果質量并能合理地解釋、分析及判斷測定結果,相信我國HbA1c測定結果的可比性會不斷改善,測定質量也會不斷提高。

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