HPV分型分析

  一.背景

  宮頸癌是女性的第二惡性腫瘤,僅次于乳腺癌,也是目前唯一一個病因明確的惡性腫瘤。據2002年統計,全球每年約有50萬新發病例,27萬多人直接死于子宮頸癌。而中國均占世界的三分之一,并且發病率和死亡率仍然在逐年上升,明顯趨向年輕化。1995年國際癌癥研究機構

(IARC)正式宣布人乳頭狀瘤病毒(HPV)某些亞型持續性感染是導致宮頸癌的最主要因素。HPV是一種主要存在于人皮膚、黏膜及女性宮頸上皮細胞異形區的病毒,目前已發現的200余種病毒亞型,為一組形態和基因結構相似但致瘤表現不同的病毒,可引起人類上皮的良性和惡性腫瘤。依據WHO國際癌癥研究機構及其他研究成果,把與宮頸癌發生有關的HPV亞型稱為高危和中危亞型,致癌性高且最常見的有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73、82(其中HPV26,53和66傾向于中度病變);與腫瘤不相關的稱為低危亞型,最常見的為HPV 6,11和81等。

  研究提示70%以上的宮頸癌患者體內均發現感染HPV16或18亞型,而在宮頸癌的發生中HPV16、18等高危亞型的致癌性遠遠高于其他亞型,美國陰道鏡及婦科病理學會將HPV16和18亞型陽性列為病理學檢測指癥。WHO主導的巴西和丹麥多中心大樣本研究提示,病毒載量是除亞型之外導致腫瘤發生發展的另一個關鍵的獨立因素。同時,大量研究也提示除亞型外,HPV的致癌性還與感染者的病毒載量相關,病毒載量被認為是一個潛在的識別CIN2及以上病理等級的生物學指標。對HPV病毒載量監測涉及到感染的細胞數以及每個感染細胞中的病毒數,因此受兩個主要因素影響:HPV病毒感染宮頸表面的范圍及感染區域的病毒水平。但由于無法控制受檢女性宮頸脫落的細胞數獲取時的差異,到目前為止很少有研究對這18個高危亞型進行分型同時又進行定量分析。

  許多研究表明,高的病毒載量已經展現與HPV持續性感染和宮頸惡性病變相關,在指導ASCUS陰道鏡的運用方面具有重要的意義,能避免一些過度的侵入性檢查。部分研究認為HPV16的病毒載量能預測病毒的持久性,可以評估婦女進展為宮頸癌的風險或者提示一個較為良好的預后。

  二.人乳頭瘤病毒核酸檢測

  人乳頭瘤病毒至今尚不能在體外培養,因而對其檢測主要依賴于分子生物學技術。目前HPV病毒基因組核酸檢測常用的方法有DNA芯片雜交法、熒光定量PCR法和雜交捕獲法。DNA芯片雜交法是基于傳統的反向斑點雜交技術,將擴增產物與固定于支持物上的檢測探針進行反應并顯色,此類方法能進行HPV病毒的分型檢測,但無法明確檢測病毒載量,而其PCR過程一般是采用通用引物,因此對于部分亞型來說其靈敏度和特異性不及型特異性引物檢測效果;實時熒光定量PCR法則可采用型特異引物探針對HPV分型檢測,并提供病毒載量定量的可能,該法將普通PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性有機結合;雜交捕獲技術(HC-Ⅱ)是一種采用免疫技術并通過化學發光使基因信號放大的微孔板檢測方法,其缺點是對HPV檢測結果難以明確具體的基因型,病毒載量的確定又會受樣本中脫落細胞取樣量的影響。綜上所述,從方法學角度來說,熒光定量PCR法為目前HPV定性及定量檢測中最優的技術平臺。

  研究提示不同HPV型別的致癌性和致癌率均有差異,臨床上對與宮頸癌相關的高危型亞型間風險等級有一定的評估,如風險等級由強到弱依次如下:HPV16、18、45、31、33等。同時致癌性最強的HPV16與宮頸鱗癌關系最為密切,而HPV18易導致宮頸腺癌。經大量臨床隨訪研究,不同亞型的持續性感染時間也不一樣,其中HPV16亞型的持續時間最長,平均為12.4月,其次是HPV31、33、52亞型,持續性研究也提示提示高危型的持續時間9.3月(平均)高于低危型的持續時間8.4月。從流行病學角度來看,通過型別區分可觀察到HPV感染型別也存在很大的地域性差異,如在西方發達國家最常見的亞型為HPV16和18,HPV45主要出現在非洲西部地區,而HPV58和52卻在中國婦女中檢出率較高,僅次于HPV16亞型。

  其次,HPV持續性感染是宮頸癌發生的必要條件,相同基因型持續性感染時會增加患宮頸癌的風險,因此區別持續性感染和一過性感染非常重要,同一型別持續性感染風險遠高于不同型別反復感染,如對丹麥哥本哈根11088名登記在冊的婦女進行為期數年的跟蹤隨訪研究,對受檢人群進行了宮頸細胞涂片檢查,HPV檢測和組織病理檢查。該研究中假定連續兩次HPV檢測陰性的危險系數為1.0,各種持續感染情況的危險系數是其與1.0的比值,結果展示:2次檢測(持續感染間隔2年)結果為陽性,且感染型別不同時則HSIL的危險系數為192.7,而2次檢測感染型別相同(至少一個亞型相同)時則HSIL的危險系數上升為813.0。同時,持續感染高危型HPV相同基因型,尤其是HPV18,應該被認為是CIN2-3復發的高危風險因子性。鑒于前期研究提示大多數婦女HPV感染是瞬時的,在2年之內可自動清除,而HPV高危亞型的型特異性持續感染是高度鱗狀上皮內病變或者宮頸癌發生的首要條件,因此在宮頸癌的早期篩查中對HPV型別區分有著重要意義,通過核酸檢測可判定病毒感染的有無并能鑒定HPV感染的型別,區分單純HPV型別感染和多重HPV型別感染,有助于提高診斷HPV持續感染的特異性。

  三.人乳頭瘤病毒定量檢測的意義

  近期,多數研究將病毒載量預測病毒的清除以及疾病的進展作為主要方向,大量的研究提示在宮頸樣本中HPV致癌型別的病毒載量測試(包括HPV16亞型)是HPV持續性感染和宮頸鱗狀上皮內瘤變發生的風險的一個合適的指示因子。

  目前對HPV定量研究的檢測方法主要有HC2和熒光定量PCR法。

  HC2是目前市面上可以用于進行半定量研究的最常見成品試劑盒,由于在市面上廣泛使用,因而有許多關于該試劑盒的HPV定量方面臨床意義的研究。但是由于HC2不考慮樣本中宮頸脫落細胞數量,無法鑒定HPV型別,也無法區分單重和多重感染,對于載量與宮頸病變等級的研究來說并不精確。而很多研究已經提示HPV病毒載量是宮頸癌的一個型別特異性生物指標,每個亞型病毒載量的臨床意義也不盡相同,因此對于病毒載量的檢測應建立在型別特異性上。

  熒光定量PCR法為目前得到普遍認可的病毒載量檢測的金標準,眾多研究采用此方法進行HPV病毒載量臨床意義的研究。因HPV為胞內病毒,HPV定量準確度一直受限于取樣的差異,而通過看家基因可準確定量取樣細胞數,獲得單位細胞內的病毒載量。因此,病毒載量的表達方式(病毒量與細胞數之間的比值)已經得到廣大研究者的認可,其載量分析相對來說更可靠也更具有可重復性——不因醫生取樣差異而導致錯誤的病毒載量。盡管很多研究者采用此方法來對HPV進行精確定量研究其臨床意義,但是各研究間采用的體系靈敏度及定量衡量的標準并不統一,因而各個研究結論間可以作為參考,但是不具備嚴格的可比性。因此對于定量的準確性建議采用WHO認可的英國國家生物制品檢定所(NIBSC)制備的HPV16和18亞型定量標準品進行統一評估。

  綜合和總結眾多研究結果可以得出定量研究的結論:

  1)HPV病毒載量是宮頸癌的一個型別特異性生物指標,對于病毒載量的研究應建立在型別特異性基礎之上;

  2)病毒載量預測HPV感染的持續性,初次檢測時病毒載量越高則持續性感染時間越長,宮頸癌發生的危險性也越高。

  3)應用于ASCUS分流,高的病毒載量已經展現與HPV持續性感染和宮頸惡性病變相關,在指導細胞學結果ASCUS后陰道鏡的運用方面具有重要的意義,能避免一些過度的侵入性檢查,尤其是HPV16的載量分析。

  4)病毒載量的檢測可以作為宮頸細胞學異常的指征之一。與此同時,尤其是應該關注細胞學結果正常但是出現高的病毒負荷的婦女。事實上,一些研究已經指出細胞學正常的但是有高的病毒載量也可能是瘤變進程的高危因子。因此,病毒載量的檢測能良好地輔助細胞學檢測進行宮頸癌的早期篩查。

  5)病毒載量檢測可以應用于宮頸癌的基線篩查中,研究提示基線篩查中高的病毒載量可以預測后續病變等級的風險。高病毒載量也被認為可能是協助辨別CIN進程中有高度風險婦女的一個候選指標。

  6)病毒載量監測能良好地應用于病人的隨訪檢測中。比起某一時段單次取樣的高病毒載量,HPV在一段時間病毒載量的增加可能更能展現病毒動力學變化更重要,也是HPV感染結果最好的預測因素。隨訪時結合型特異性病毒載量的檢測可以區別瞬時感染還是持續性感染改變,更能預測高級別CIN進程的風險或提示一個較為良好的預后。

  因而,HPV分型和定量檢測對臨床有重要的指導意義,宮頸癌的早期篩查及隨訪,分流等過程中對HPV分型和定量同時檢測,即對單個病人定期進行高危型尤其是HPV16亞型病毒載量的檢測,觀察病毒載量隨著時間的推移及治療措施等的變化,預測宮頸癌的進展或消除。

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